Badania w kierunku analizy włosów prowadzono już od lat 40’ XX wieku, zaś szybki rozwój przypadł na lata 70’-80’. Dotychczas ukazało się około tysiąca publikacji dotyczących włosów jako materiału analitycznego. Początkowo oznaczano we włosach zawartość pierwiastków metalicznych, ze szczególnym uwzględnieniem ołowiu, arsenu, rtęci i kadmu. Wkrótce zainteresowanie wzbudziła możliwość analizy różnych ksenobiotyków, w tym leków, trucizn organicznych oraz substancji uzależniających.
Czym jest włos
Włosy powstające z komórek naskórka są zrogowaciałymi włóknami (pili) i są charakterystyczne dla ssaków. Tylko niewielkie rejony ciała pozostają nieowłosione. U większości zwierząt owłosienie tworzy gęstą okrywę i tylko u ludzi jest zredukowane, występując w większym zagęszczeniu na głowie, pod pachami oraz w okolicach intymnych. U płodu włosy zawiązują się od trzeciego miesiąca, a w siódmym pokryta jest już prawie cała skóra. Narząd włosowy składa się z mieszka włosowego, gruczołu łojowego, gruczołu apokrynowego (niektóre rejony) i mięśnia przywłosowego. Sam włos zbudowany jest z łodygi, korzenia włosa, cebulki i brodawki włosowej.
Rozwój włosa dzieli się na trzy fazy: wzrost (anagen), inwolucja (katagen) i spoczynek (telogen). Czas trwania poszczególnych faz jest zależny od rejonu ciała. W obrębie głowy około 90% włosów jest w fazie anagenu, który trwa od 2 do 6 lat, następna faza, katagen, trwa 2-3 tygodnie, a faza telogen kilka miesięcy. Po tym czasie włos wypada. W przybliżeniu 15% włosów głowy jest w fazie uśpienia.
Przyjmuje się, że włosy rosną 1cm±0,2cm w ciągu miesiąca. Analizując segmenty włosa o długości 1 cm, odpowiadające kolejnym miesiącom, można wykryć obecność substancji, pomimo że pacjent w tym czasie jej nie zażywał. Jest to tzw. echo, czyli pozostałość substancji, która została wbudowana do włosa w trakcie gdy pacjent spożywał dany związek, po czym włos przeszedł w fazę uśpienia, czyli przestał rosnąć. Efekt ten ma wpływ na wynik analizy. Sformułowano zasadę, że zawartość substancji w segmencie musi być większa niż 15% zawartości tej substancji w segmencie z poprzedzającego miesiąca.
Wokół mieszka włosowego znajduje się sieć naczyń włosowatych, najbardziej rozwinięta w jego dolnym odcinku. W fazie anagenu są one bardzo rozwinięte, zaś w katagenie częściowo zanikają. Włos zbudowany jest w 65-95% z białka (głównie keratyna), w 1-9% z tłuszczów, w 0,1-5% z pigmentów (melaniny), pozostałą część stanowią pierwiastki śladowe, polisacharydy i woda. Ważnym składnikiem włosa jest melanina, produkowana przez melanocyty, która w trakcie wzrostu włosa przechodzi z cebulki do łodygi. Są dwa rodzaje melaniny: eumelanina i feomelanina. Kolor włosów jest zależny od zawartości tych składników. Im ciemniejsze włosy, tym więcej zawierają eumelaniny, feomelaniny jest zaś dużo w rudych włosach. Siwe włosy nie zawierają melaniny w ogóle. (…).
Kierunki analizy włosów
Najwcześniej zaczęto analizować włosy na zawartość antymonu pod kątem potrzeb analizy toksykologiczno-sądowej. W wielu publikacjach stwierdzono występowanie korelacji między zawartością pierwiastków metalicznych we włosach a przebytymi chorobami, nieprawidłowościami metabolicznymi, statusem odżywiania, skażeniem środowiska. Bada się także zależność składu stabilnych izotopów we włosach od niedożywienia i głodu. Porównując stosunek izotopów ciężkich do lekkich u badanych osób, ze standardowym stosunkiem tych izotopów u osób zdrowych, można monitorować nawet krótkie zmiany w żywieniu, a także wykryć niedożywienie np. jako domniemany powód śmierci (zastosowanie w medycynie sądowej). Obecnie można już standardowo analizować skład pierwiastkowy włosa. Badając zawartość poszczególnych składników można dopasować odpowiednią dietę w celu polepszenia kondycji całego organizmu. (…).
Zbadano zawartości różnych pierwiastków u osób chorych w porównaniu z podobną grupą osób zdrowych. Stwierdzono niedobór żelaza u pacjentów z chorobą Parkinsona (…). Zauważono wielokrotnie wyższy poziom ołowiu, glinu, chromu, molibdenu, wanadu, kadmu, kobaltu i niklu u dzieci z autyzmem, podwyższoną zawartość antymonu u osób z rakiem, większą ilość kadmu a mniejszą żelaza u osób z nadciśnieniem, mniejszą zawartość miedzi u osób opóźnionych psychicznie. (…).
Zbadano zawartość toksycznych metali we włosach mieszkańców prowincji Guizhou w Chinach, w której produkuje się ponad 70% całej ilości rtęci w tym kraju. Zauważono, że metylowana rtęć jest dobrym wskaźnikiem narażenia populacji na oddziaływanie tego metalu, gdyż prawie nie istnieją naturalne zewnętrzne źródła zanieczyszczenia metylortęcią, odkładającą się we włosach.
Wykorzystanie włosów jako materiału analitycznego umożliwia wiele praktycznych zastosowań. Obecnie w niektórych krajach badania włosów są stosowane na szeroką skalę, w innych planuje się ich wprowadzenie. W Niemczech wymagana jest abstynencja od środków odurzających i marihuany w okresie 1 roku przed ubieganiem się o prawo jazdy. Przyjmuje się, że nie powinno być śladów zakazanych substancji w części włosów o długości 12 cm. Podobne wytyczne są stosowane w stosunku do osób ubiegających się o powtórny egzamin na prawo jazdy, po jego utracie ze względu na prowadzenie „pod wpływem”. We Włoszech są badane dwie próbki włosów o długości 4-5 cm na obecność opiatów i kokainy.
Badania włosów na zawartość substancji zakazanych są szeroko stosowane w postaci testów skriningowych w szkołach, więzieniach, a także w badaniach przedstawicieli zawodów zaufania publicznego jak: lekarz, pielęgniarka, wojskowy, policjant, pilot. Najczęściej są one stosowane w Stanach Zjednoczonych, gdzie pracodawcy w ofercie zatrudnienia mogą postawić warunek dotyczący zbadania włosów na obecność związków zakazanych, jeśli praca dotyczyć będzie sektora publicznego bezpieczeństwa lub pracodawca związany jest umową z rządem.
Analiza włosów zawsze zajmowała ważną pozycję w medycynie sądowej. Często włosy stanowią jedyny materiał biologiczny, gdyż inne standardowo stosowane próbki biologiczne nie są dostępne na miejscu przestępstwa. Zatrucie niektórymi substancjami może zostać odkryte dopiero jakiś czas po śmierci, kiedy już nie można poddać analizie ani krwi, ani moczu. Są także związki, które w organizmie są bardzo szybko metabolizowane (flunitrazepam – „tabletka gwałtu”), stąd zastosowanie próbki krwi, moczu lub treści żołądkowej nie daje pozytywnych wyników. Wtedy pozostaje analiza włosa, która umożliwia badanie retrospektywne. Podobnie jest w przypadku ekshumowanych zwłok, przy zaawansowanym stopniu ich rozkładu.
Badania włosów mają też zastosowanie w orzecznictwie sądowym, w sprawach rozwodowych i o opiekę nad dzieckiem, w uzasadnionych przypadkach analizuje się włosy małżonków i rodziców w celu wykluczenia nadużywania substancji zakazanych czy alkoholu. Podobne testy wykonuje się przy sprawdzeniu wiarygodności zeznań świadków.
Badania moczu są standardowym postępowaniem stosowanym w monitorowaniu terapii odwykowej, ale pozwalają one na wykrycie nadużywania zabronionych substancji tylko w przeciągu ostatnich kilku dni (2 do 3 dni). Osoby uzależnione znają możliwości diagnostyczne testów na zawartość kokainy, THC lub amfetaminy w moczu, i wiedzą do kiedy można przyjąć daną substancję, aby nie została wykryta i jak ewentualnie można próbować ją maskować. Analiza włosów i limity oznaczalności związków nie są jeszcze powszechnie znane, a zafałszowanie wyniku jest trudniejsze.
Substancje są wbudowywane w strukturę włosa po pewnym czasie od przyjęcia, a ich oznaczenie jest możliwe dopiero po około jednym tygodniu. Jak donosi Moeller, na 95% pozytywnych wyników na metadon aż 69% dało wynik pozytywny na opiaty i 43% na kokainę, co oznacza, że w trakcie kuracji metadonowej osoby te przyjmowały substancje zakazane, które mogły nie zostać wykryte przy standardowych testach moczu. Analiza włosów pozwala więc sprawdzać wiarygodność kuracji odwykowej.
Analiza włosów znalazła także zastosowanie w antropologii. Zbadano włosy 500-letniej mumii, w których wykryto obecność kokainy. Może to wskazywać na osobę, która zażywała kokainę lub przebywała w środowisku nią zanieczyszczonym. We włosach mumii egipskich także stwierdzono obecność kokainy, nikotyny i kotyniny. Zawartość dwóch ostatnich może być związana z procesem odymiania lub balsamowania zwłok, ale nie jest do końca wyjaśniona. Ze względu na dużą porowatość próbek zwykłe metody stosowane do dekontaminacji okazały się niewystarczające. W tych przypadkach trzeba także wziąć pod uwagę możliwość zanieczyszczenia zewnętrznego – niektóre mumie, np. Ramzesa II, były przenoszone do innego grobowca nawet kilkakrotnie. Konieczne więc wydaje się opracowanie specjalnych procedur oczyszczania próbek „historycznych” włosów. Interesujący jest także przypadek poety Johna Keatsa, który ze względu na to, iż chorował na gruźlicę, sam sobie przepisywał i ordynował morfinę, którą w 167 lat po jego śmierci wykryto, analizując jego włosy.
Włosy mogą też być cennym materiałem w badaniach epidemiologicznych monitorujących skażenie środowiska i narażenie pracowników. Badano np. zawartość hydroksylowych pochodnych policyklicznych węglowodorów aromatycznych (OH-PAH) we włosach jako wskaźnik długotrwałej ekspozycji na te związki, np. przy produkcji aluminium, kładzeniu nawierzchni dróg, spalaniu paliw kopalnych, w transporcie. Oznaczano zawartość arsenu we włosach osób zamieszkujących rejon jeziora zawierającego dużą ilość tego pierwiastka, a także zawartość pestycydów jak 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorofenylo)etan (DDT) i jego pochodne, heksachlorocykloheksan (HCH), heksachlorobenzen (HCB), heptachlor, dioksyny w tym polichlorowane dibenzodioksyny (PCDD), polichlorowane dibenzofurany (PCDF) oraz polichlorowane bifenyle (PCB).
W badaniach antydopingowych analizuje się substancje, które mają bezpośredni wpływ na wyniki uzyskiwane w trakcie zawodów sportowych. Lista takich związków jest ściśle określona, łącznie z limitami ich zawartości. Substancje farmakologiczne nie ujęte na liście, ale nie będące zarejestrowanymi lekami dla ludzi, także są zakazane. Analiza włosów mogłaby znaleźć zastosowanie dla substancji, których efekt jest długotrwały i może wpływać na wyniki sportowców, np. steroidy anaboliczne (wpływają na przyrost masy mięśniowej), a szczególnie ich prekursory, które nie występują w organizmie. Badanie i interpretacja zawartości endogennych steroidów są bardziej skomplikowane, wymagają szczegółowej analizy procesów biotransformacji, obecności metabolitów oraz dokładnej charakterystyki pacjenta. Analiza dopingu jest bardzo trudna, gdyż w przypadku wielu substancji wymaga opracowania limitów dozwolonych wyłącznie dla celów terapeutycznych (TUE), np. u osób chorych, po zabiegach etc. Wiele związków jest zakazanych tylko w okresie trwania zawodów, co też musi być uwzględnione w badaniach. Zastosowanie analizy włosów w dopingu nie jest jeszcze stosowane, wyjątek stanowi Francja, ale nawet w tym kraju nie jest to do końca usankcjonowane prawnie. Testy substancji dopingujących we włosach wymagają jeszcze szerszych badań oraz określenia zasad ich stosowania w badaniu antydopingowym przeprowadzanym przez agencje odpowiedzialne za badanie sportowców.
We włosach można także oznaczać substancje endogenne jak kortyzol, który produkowany jest w organizmie w odpowiedzi na stres. Analiza kortyzolu we włosach jako potencjalnego biomarkera narażenia na chroniczny stres może pomóc w zrozumieniu roli tego czynnika w przebiegu wielu chorób, np. zawału mięśnia sercowego.
Można także oznaczać inne hormony steroidowe, jak estradiol, progesteron i testosteron, w przypadku których wykryto istnienie silnej zależności pomiędzy stężeniem w osoczu a stężeniem we włosach. Są także prace, w których oznaczano profil lipidowy we włosach, odzwierciedlający zawartość lipidów we krwi. Otrzymano pełny profil lipidów we włosach, przy zastosowaniu tylko 20 mg próbki. Scharakteryzowano skład lipidowy włosa od proksymalnej części aż po zakończenie łodygi. Zastosowanie tej metody pozwala na zbadanie zmiany indywidualnego składu włosów w odpowiedzi na różne czynniki zewnętrzne.
Kliniczne zastosowania analizy włosów
Na oddziałach psychiatrycznych nie zawsze jest możliwe przeprowadzenie wiarygodnego wywiadu dotyczącego przyjmowanych przez pacjenta leków. Autorzy kilku prac badawczych zalecają przeprowadzenie analizy włosów przed przyjęciem do szpitala, gdyż objawy psychotyczne mogą być spowodowane środkami psychostymulującymi, a nie chorobą o podłożu psychicznym, co wymaga innego leczenia. Odpowiednia diagnostyka w tych przypadkach daje możliwość zastosowania indywidualnej terapii.
Badano także włosy w przebiegu farmakoterapii padaczki, gdzie stwierdzono korelację pomiędzy wielkością dziennej dawki karbamazepiny czy fenobarbitalu a zawartością tych leków w jednocentymetrowych segmentach włosów odpowiadających jednemu miesiącowi. Taka analiza daje możliwość bieżącej obserwacji terapii pacjenta.
Włosy noworodków i matek stosowane są także w analizie toksykologicznej, gdzie istnieje podejrzenie o nadużycie różnych substancji farmakologicznych niewskazanych w okresie ciąży. Często wywiad przeprowadzany z matkami nie jest wiarygodny, gdyż kobiety mimo zagrożenia życia ich dzieci nie przyznają się do nadużywania tych substancji. Symptomy występujące u noworodków nie zawsze są swoiste dla zatrucia narkotykowego, a analiza toksykologiczna włosa dziecka, często też matki, pozwala poznać substancje, które były nadużywane i zastosować skuteczną terapię odtruwającą. Niektóre szpitale, np. akademicki Szpital dla Chorych Dzieci w Toronto, prowadzą The Motherisk Program, w którym poddają rutynowej kontroli włosy matek i noworodków. Próbki są pobierane od osób wybranych przez system z bazy Motherisk, czyli z grup ryzyka. Włosy badane są na obecność amfetaminy i kokainy. W wyniku tego programu zaobserwowano, że metamfetamina także przechodzi przez łożysko oraz że nie u wszystkich matek biorących kokainę przeszła ona przez łożysko do dziecka. Zbadano także zawartość metamfetaminy i amfetaminy w smółce i włosach. Te wyniki traktowane kompleksowo stanowią dowód zażywania w ciąży narkotyków. Przy analizie włosów noworodków ilość pobranej próbki jest krytyczna, gdyż wiele noworodków ma bardzo mało włosów lub wręcz nie ma ich wcale. Są doniesienia, że 5 mg próbki daje już bardzo dobre wyniki. We włosach nowonarodzonych dzieci oznaczano także tyroksynę, czym potwierdzono przechodzenie hormonów matki przez łożysko.
W badaniach zdrowia publicznego ważne miejsce zajmują analizy w przypadku osób palących tytoń. Ze względu na działanie toksyczne nikotyny (powiązane z rakiem, chorobami serca, nadciśnieniem etc.) ważne są nieinwazyjne metody rozpoznawania ryzyka u biernych palaczy. Oznaczanie nikotyny (czasami też jej metabolitu – kotyniny) we włosach jest wiarygodnym markerem pasywnej ekspozycji na tytoń.
Coraz częściej oznacza się także we włosach glukuronid etylu (EtG) i estry etylowe kwasów tłuszczowych (mirystynowego, palmitynowego, oleinowego, stearynowego), czyli FAEE, jako markery konsumpcji alkoholu. Mają one zastosowanie w monitoringu abstynencji od alkoholu (sprawdzanie: pacjentów, pracowników, osób ubiegających się o ponowne wydanie prawa jazdy. Zaobserwowano, że możliwe jest wykrycie EtG we włosach z brody nawet po jednokrotnym podaniu doustnym 153-200 g etanolu w czasie 5.5 godziny. Maksimum stężenia metabolitu wykryto po 2-4 dniach od spożycia, ale jest on już oznaczalny po 14 godzinach w stężeniu 6,7- 46 pg/mg. Limity zaproponowane przez Society of Hair Testing (SoHT) wynoszą dla EtG ≥ 7 pg/mg w segmentach proksymalnych 0-3 cm aż do 0-6 cm, dla FAEE (suma wszystkich czterech) ≥200pg/mg dla 0-3cm i ≥400pg/mg dla 0-6 cm włosów. Wartości powyżej tych limitów wskazują na nadużywanie alkoholu.
Oznaczanie ksenobiotyków we włosach z innych części ciała
Jak zostało wcześniej wspomniane, do oznaczeń można także używać włosów z innych regionów ciała niż z głowy: z pach, łona, z brody, z rąk. Takie próbki wymagają szczególnej interpretacji, gdyż włosy zlokalizowane w różnych częściach ciała rosną inaczej i mogą być w odmiennych fazach wzrostu. Porównania dostępne w literaturze wskazują na to, że substancje można wykryć we wszystkich rodzajach włosów i często zawartości są porównywalne (czasami wyższe we włosach łonowych), a ilość substancji oryginalnej jest zawsze większa niż jej metabolitu. Ze względu na dobrą korelację pomiędzy włosami z głowy a z pach i łonowymi, mogą być one alternatywą, gdy nie jest możliwe pobranie próbki z głowy. (…).
Etapy przygotowania próbek
Materiał biologiczny, jakim są włosy, wymaga odpowiedniego przygotowania. Analiza składa się z kilku etapów, w których jednym z najważniejszych jest dekontaminacja próbki z zanieczyszczeń zewnętrznych. Później po wysuszeniu i homogenizacji włosów należy wyekstrahować oznaczane substancje z matrycy włosa. Wymagane jest zastosowanie odpowiedniego procesu izolacji w zależności od rodzaju związku. W zależności od przyjętej metody oznaczania, próbki można poddać oczyszczaniu i derywatyzacji. (…).
Możliwości i ograniczenia analizy włosów
Przyjmuje się, że włosy rosną ok. 1cm ± 0,2cm na miesiąc, tak więc zastosowanie ich jako materiału analitycznego daje możliwość obserwacji kilku lub nawet kilkunastu miesięcy terapii lub intoksykacji. Jest to jeden z nielicznych materiałów o tak dużym oknie czasowym.
Pobranie próbki jest bardzo łatwe, wystarczy odpowiednio poinstruować osoby odpowiedzialne. Nie jest krępujące jak pobranie moczu, ani inwazyjne jak pobranie krwi. Po związaniu odcina się próbkę włosów, grubości ołówka, z tylnej części głowy lub ze środka jak najbliżej skóry. Należy także zaznaczyć korzeń włosa. Próbkę można przechowywać praktycznie bez ograniczeń czasowych w temperaturze pokojowej, odpowiednio zabezpieczoną, bez dostępu światła. (…).
Badanie próbki nie jest możliwe bezpośrednio po podaniu (spożyciu) oznaczanego związku. Najwcześniej, jak wspomniano, jest to możliwe w przypadku włosów z brody, np. po ok. 14 godzinach od spożycia alkoholu.
Powszechne skażenie środowiska niektórymi substancjami, np. nikotyną ze względu na obecność dymu tytoniowego w powietrzu, lub kokainą z powodu obecności trudnych do usunięcia śladów tego związku z włókien ubrań i banknotów powoduje, że analiza włosów i interpretacja jej wyników jest utrudniona. Trzeba uwzględniać stopień skażenia środowiska i jego wpływ na zanieczyszczenie włosów.
Stosowanie kosmetyków, w których zawarte są substancje oznaczane, może powodować zafałszowanie wyników analizy. Tu godna uwagi jest publikacja Sporkert, w której autorzy donoszą o zewnętrznym zanieczyszczeniu etyloglukuronidem z preparatów stosowanych na włosy.
Zabiegi kosmetyczne mają także istotny wpływ na zawartość oznaczanych we włosach związków. Podczas farbowania włosów, a szczególnie rozjaśniania, stężenie EtG we włosach zmniejsza się aż o 80%.
Źródło:
Izabela Łuczak-Zielkiewicz*, Mirosław M. Szutowski*, Wartość diagnostyczna włosów, Biul. Wydz. Farm. WUM, 2013, 8, s. 56-64.
*Zakład Toksykologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa.
